https://youtu.be/Oz-OWU-qJ7c
quinta-feira, 16 de março de 2017
quarta-feira, 15 de março de 2017
Eletroforese
Eletroforese:
A eletroforese é uma técnica de separação de partículas de acordo com sua carga elétrica e peso molecular. Permite a separação de frações de moléculas orgânicas como RNA, DNA, proteínas e enzimas, pela migração destas em um gel durante a aplicação de um potencial elétrico.
O princípio da eletroforese utilizada para separação de DNA, por exemplo, baseia-se na carga total negativa do DNA (dada pelos oxigênios do grupamento fosfato). Assim, fragmentos de DNA obtidos da técnica de PCR, podem ser separados pela aplicação de uma voltagem. Ao final do processo, as cadeias de DNA estarão próximas ao polo positivo.
Moléculas de menor peso molecular terão mais facilidade de migrar pelo gel do que as de maior peso molecular, e percorrerão uma distância maior ficando mais próximas do pólo positivo.
Na técnica, utiliza-se um cuba com dois compartimentos separados. Os eletrodos determinam os pólos positivo e negativo em cada compartimento. Neles, coloca-se uma solução salina que conduz eletricidade. Entre os compartimentos, ajusta-se o gel que deve ficar submerso.
As amostras (de DNA, por exemplo) são colocadas com pipetas em pequenos poços no gel, que são feitos com um pente durante a sua preparação. Antes, porém, elas são misturadas a um corante, chamado gel loading buffer. Esse corante é uma solução composta de azul de bromofenol (e/ou xileno cianol) e glicerol e é utilizado para aumentar a densidade das amostras, impedindo que elas saiam dos poços, além de dar a coloração que serve como indicador do progresso eletroforético. Para a migração, aplica-se voltagem e corrente elétrica ao sistema.
A distância que o fragmento percorreu a partir do ponto de aplicação, é comparada com a distância que outros fragmentos de tamanhos conhecidos percorreram no mesmo gel. Esses fragmentos são os ladders (marcadores de peso molecular), misturas de segmentos de DNA de tamanhos variáveis e equidistantes entre si, e que são aplicados em um poço no gel no início do processo.
Tanto na eletroforese com gel de acrilamida como na com gel de agarose, a separação das moléculas terá sua eficácia determinada tanto pela concentração do polímero como pela intensidade da voltagem e amperagem aplicadas.
1 - Gel;
2 - Aplicação do marcador;
3 - Aplicação das amostras;
4 - Indução de corrente elétrica;
5 - Deslocamento e separação dos fragmentos;
6-Eletroforese realizada.
Eletroforese em gel de agarose
É empregada rotineiramente para separação de ácidos nucléicos. A agarose é um polímero de elevado custo extraído de algas marinhas. Forma uma rede que “segura” as moléculas durante a migração.
Dependendo da concentração de agarose, tem-se uma diferença no gradiente de separação. Quanto maior a concentração, maior a capacidade de distinguir fragmentos, ou seja, maior a definição. Os géis de agarose são, geralmente, corados com soluções de brometo de etídio (EtBr), uma substância intercalante que revela os ácidos nucléicos ao fluorescer sob luz ultravioleta.
Eletroforese em gel de poliacrilamida
A poliacrilamida é uma mistura de dois polímeros: acrilamida e bisacrilamida. A acrilamida é uma molécula linear, enquanto que a bisacrilamida é em forma de "T". Misturando essas duas moléculas, tem-se a formação de uma "rede".
Diferentes relações entre as concentrações dessa moléculas permitem a criação de diferentes gradientes de separação. Para preparar um gel de poliacrilamida, deve-se misturar as duas substâncias formadoras nas concentrações desejadas, colocá-las em um suporte de vidro, e adicionar Temed e S208, que atuam como catalizadores da polimerização. A identificação dos produtos pode ser feita pelo brometo de etídio, mas o nitrato de prata é mais utilizado.
http://www.biomedicinabrasil.com/2010/10/eletroforese.html?m=1
A eletroforese é uma técnica de separação de partículas de acordo com sua carga elétrica e peso molecular. Permite a separação de frações de moléculas orgânicas como RNA, DNA, proteínas e enzimas, pela migração destas em um gel durante a aplicação de um potencial elétrico.
O princípio da eletroforese utilizada para separação de DNA, por exemplo, baseia-se na carga total negativa do DNA (dada pelos oxigênios do grupamento fosfato). Assim, fragmentos de DNA obtidos da técnica de PCR, podem ser separados pela aplicação de uma voltagem. Ao final do processo, as cadeias de DNA estarão próximas ao polo positivo.
Moléculas de menor peso molecular terão mais facilidade de migrar pelo gel do que as de maior peso molecular, e percorrerão uma distância maior ficando mais próximas do pólo positivo.
Na técnica, utiliza-se um cuba com dois compartimentos separados. Os eletrodos determinam os pólos positivo e negativo em cada compartimento. Neles, coloca-se uma solução salina que conduz eletricidade. Entre os compartimentos, ajusta-se o gel que deve ficar submerso.
As amostras (de DNA, por exemplo) são colocadas com pipetas em pequenos poços no gel, que são feitos com um pente durante a sua preparação. Antes, porém, elas são misturadas a um corante, chamado gel loading buffer. Esse corante é uma solução composta de azul de bromofenol (e/ou xileno cianol) e glicerol e é utilizado para aumentar a densidade das amostras, impedindo que elas saiam dos poços, além de dar a coloração que serve como indicador do progresso eletroforético. Para a migração, aplica-se voltagem e corrente elétrica ao sistema.
A distância que o fragmento percorreu a partir do ponto de aplicação, é comparada com a distância que outros fragmentos de tamanhos conhecidos percorreram no mesmo gel. Esses fragmentos são os ladders (marcadores de peso molecular), misturas de segmentos de DNA de tamanhos variáveis e equidistantes entre si, e que são aplicados em um poço no gel no início do processo.
Tanto na eletroforese com gel de acrilamida como na com gel de agarose, a separação das moléculas terá sua eficácia determinada tanto pela concentração do polímero como pela intensidade da voltagem e amperagem aplicadas.
1 - Gel;
2 - Aplicação do marcador;
3 - Aplicação das amostras;
4 - Indução de corrente elétrica;
5 - Deslocamento e separação dos fragmentos;
6-Eletroforese realizada.
Eletroforese em gel de agarose
É empregada rotineiramente para separação de ácidos nucléicos. A agarose é um polímero de elevado custo extraído de algas marinhas. Forma uma rede que “segura” as moléculas durante a migração.
Dependendo da concentração de agarose, tem-se uma diferença no gradiente de separação. Quanto maior a concentração, maior a capacidade de distinguir fragmentos, ou seja, maior a definição. Os géis de agarose são, geralmente, corados com soluções de brometo de etídio (EtBr), uma substância intercalante que revela os ácidos nucléicos ao fluorescer sob luz ultravioleta.
Eletroforese em gel de poliacrilamida
A poliacrilamida é uma mistura de dois polímeros: acrilamida e bisacrilamida. A acrilamida é uma molécula linear, enquanto que a bisacrilamida é em forma de "T". Misturando essas duas moléculas, tem-se a formação de uma "rede".
Diferentes relações entre as concentrações dessa moléculas permitem a criação de diferentes gradientes de separação. Para preparar um gel de poliacrilamida, deve-se misturar as duas substâncias formadoras nas concentrações desejadas, colocá-las em um suporte de vidro, e adicionar Temed e S208, que atuam como catalizadores da polimerização. A identificação dos produtos pode ser feita pelo brometo de etídio, mas o nitrato de prata é mais utilizado.
http://www.biomedicinabrasil.com/2010/10/eletroforese.html?m=1
Fracionamento
O fracionamento celular é utilizado para isolar os diferentes componentes celulares e consiste na homogeneização ou destruição das células por meio de diferentes procedimentos mecânicos ou químicos. Estes procedimentos rompem as membranas plasmáticas e separam as frações subcelulares através, da centrifugação, de acordo com sua massa, superfície e peso específicos.
Diversos métodos de centrifugação de homogeneizados são utilizados e a maioria está em solução, geralmente de sacarose, de diferentes concentrações. São utilizadas soluções de açucares devido seu potencial de ajustar-se corretamente e manter a integridade das organelas liberadas da célula.
O objetivo principal do fracionamento subcelular é que ocorra a ruptura da Membrana
Plasmática e que não ocorra à destruição das organelas celulares. Os principais métodos para que isso ocorra são a sonicação, trituração com homogeneizadores mecânicos ou tratamento com maceradores de alta velocidade. Algumas organelas celulares possuem a característica de permanecerem intactas e outras à de se fragmentarem após estes processos.
O objetivo é estudar as formas de isolamento e purificação de organelas celulares e as suas características bioquímicas. Bem como saber qual o método mais indicado para o fracionamento da célula a ser estudada e das organelas, para obter os resultados desejados. Conhecer também as etapas necessárias para o fracionamento nos fornecer os componentes desejados e em condições de uso para o seu estudo.
FRACIONAMENTO SUBCELULAR
O fracionamento subcelular é muito importante para o estudo da química celular, sendo a técnica utilizada para a separação e purificação dos componentes celulares e subcelulares. Os métodos de fracionamento celular realizam a destruição dos limites da célula por diferentes métodos mecânicos ou químicos através da centrifugação de homogeneizados.
A separação das frações subcelulares ocorre de acordo com a massa, superfície e densidade da organela celular. Devido a estas características é possível realizar a análise de diversas frações subcelulares por meio de métodos bioquímicos e microquímicos. Em geral são empregadas soluções de sacarose ou outros açucares. Isto porque as concentrações de açucares podem ser corretamente ajustadas para manter a integridade das organelas liberadas da célula.
O primeiro passo para a purificação de uma célula é o rompimento da Membrana
Plasmática sob condições em que não ocorra a destruição dos componentes internos da célula. Os quatro procedimentos mais utilizados são a Sonicação, uso de Homogeneizador a Alta Pressão, o uso de Maceradores de Alta Velocidade (Moinho de bolas) e o uso de Detergentes.
A Sonicação é exposição da célula a vibrações da ordem de 20kHz convertidos em um meio líquido, causando o fenômeno da cavitação. Essas vibrações geram focos de baixa pressão no líquido suficientes para a formação de bolhas muito pequenas. A medida que se prolonga o tempo das vibrações essas bolhas entram em colapso, gerando uma onda de choques que circulam pelo meio líquido e resultam em impacto e aumento da tensão de cisalhamento, o que causa o rompimento celular. O aparelho utilizado chama-se “sonicador” e transmite a energia ultra-sônica por uma sonda
Homogeneizadores a Alta Pressão tem como princípio de funcionamento o forçamento da passagem da suspensão celular por um orifício estreito seguida de colisão contra uma superfície rígida e imóvel em uma câmara à pressão atmosférica, ou colisão contra um segundo fluxo sob pressão elevada. A redução instantânea da pressão associada ao impacto provoca o rompimento celular sem danificar biomoléculas. Esse rompimento provoca aumento da temperatura do meio, e, por causa disso, o equipamento deve ter um eficiente sistema de refrigeração, principalmente nos casos em que a molécula-alvo é termossensível.
No tratamento com Maceradores de Alta Velocidade as células são esmagadas entre as paredes de um frasco de vidro e um bastão que gira dentro dele. As condições de rompimento nesse equipamento são facilmente controláveis e a eficiência do processo depende da geometria da câmara de rompimento, da velocidade e do tipo de agitador, do tamanho das esferas, da carga das esferas e da concentração celular, da velocidade de alimentação e da temperatura.
Abertura dos orifícios da Membrana Plasmática pode também ser feita através do uso de Detergentes Suaves. Como exemplo de agentes tensoativos há os sais biliares, o lauril sulfato de sódio, o SDS (dodecil sulfato de sódio) e o Triton. A eficiência do rompimento depende do pH e da temperatura e pode ser aumentada por um pré-tratamento à base de solventes orgânicos, como a acetona, que iniciam a estimular a autólise.
Ainda há o rompimento celular através de solventes e lize enzimática, que são processos utilizados para hidrolisar paredes de células microbianas.
Quando aplicada com cuidado, a homogeneização deixa intacta a maioria das organelas celulares. Esses procedimentos quebram a Membrana Plasmática em pequenos fragmentos, no entanto, o núcleo, os lisossomos, os peroxissomos, as mitocôndrias e cloroplastos permanecem intactos.
O fracionamento celular é utilizado para isolar os diferentes componentes celulares e consiste na homogeneização ou destruição das células por meio de diferentes procedimentos mecânicos ou químicos. Estes procedimentos rompem as membranas plasmáticas e separam as frações subcelulares através, da centrifugação, de acordo com sua massa, superfície e peso específicos.
Diversos métodos de centrifugação de homogeneizados são utilizados e a maioria está em solução, geralmente de sacarose, de diferentes concentrações. São utilizadas soluções de açucares devido seu potencial de ajustar-se corretamente e manter a integridade das organelas liberadas da célula.
O objetivo principal do fracionamento subcelular é que ocorra a ruptura da Membrana
Plasmática e que não ocorra à destruição das organelas celulares. Os principais métodos para que isso ocorra são a sonicação, trituração com homogeneizadores mecânicos ou tratamento com maceradores de alta velocidade. Algumas organelas celulares possuem a característica de permanecerem intactas e outras à de se fragmentarem após estes processos.
O objetivo é estudar as formas de isolamento e purificação de organelas celulares e as suas características bioquímicas. Bem como saber qual o método mais indicado para o fracionamento da célula a ser estudada e das organelas, para obter os resultados desejados. Conhecer também as etapas necessárias para o fracionamento nos fornecer os componentes desejados e em condições de uso para o seu estudo.
FRACIONAMENTO SUBCELULAR
O fracionamento subcelular é muito importante para o estudo da química celular, sendo a técnica utilizada para a separação e purificação dos componentes celulares e subcelulares. Os métodos de fracionamento celular realizam a destruição dos limites da célula por diferentes métodos mecânicos ou químicos através da centrifugação de homogeneizados.
A separação das frações subcelulares ocorre de acordo com a massa, superfície e densidade da organela celular. Devido a estas características é possível realizar a análise de diversas frações subcelulares por meio de métodos bioquímicos e microquímicos. Em geral são empregadas soluções de sacarose ou outros açucares. Isto porque as concentrações de açucares podem ser corretamente ajustadas para manter a integridade das organelas liberadas da célula.
O primeiro passo para a purificação de uma célula é o rompimento da Membrana
Plasmática sob condições em que não ocorra a destruição dos componentes internos da célula. Os quatro procedimentos mais utilizados são a Sonicação, uso de Homogeneizador a Alta Pressão, o uso de Maceradores de Alta Velocidade (Moinho de bolas) e o uso de Detergentes.
A Sonicação é exposição da célula a vibrações da ordem de 20kHz convertidos em um meio líquido, causando o fenômeno da cavitação. Essas vibrações geram focos de baixa pressão no líquido suficientes para a formação de bolhas muito pequenas. A medida que se prolonga o tempo das vibrações essas bolhas entram em colapso, gerando uma onda de choques que circulam pelo meio líquido e resultam em impacto e aumento da tensão de cisalhamento, o que causa o rompimento celular. O aparelho utilizado chama-se “sonicador” e transmite a energia ultra-sônica por uma sonda
Homogeneizadores a Alta Pressão tem como princípio de funcionamento o forçamento da passagem da suspensão celular por um orifício estreito seguida de colisão contra uma superfície rígida e imóvel em uma câmara à pressão atmosférica, ou colisão contra um segundo fluxo sob pressão elevada. A redução instantânea da pressão associada ao impacto provoca o rompimento celular sem danificar biomoléculas. Esse rompimento provoca aumento da temperatura do meio, e, por causa disso, o equipamento deve ter um eficiente sistema de refrigeração, principalmente nos casos em que a molécula-alvo é termossensível.
No tratamento com Maceradores de Alta Velocidade as células são esmagadas entre as paredes de um frasco de vidro e um bastão que gira dentro dele. As condições de rompimento nesse equipamento são facilmente controláveis e a eficiência do processo depende da geometria da câmara de rompimento, da velocidade e do tipo de agitador, do tamanho das esferas, da carga das esferas e da concentração celular, da velocidade de alimentação e da temperatura.
Abertura dos orifícios da Membrana Plasmática pode também ser feita através do uso de Detergentes Suaves. Como exemplo de agentes tensoativos há os sais biliares, o lauril sulfato de sódio, o SDS (dodecil sulfato de sódio) e o Triton. A eficiência do rompimento depende do pH e da temperatura e pode ser aumentada por um pré-tratamento à base de solventes orgânicos, como a acetona, que iniciam a estimular a autólise.
Ainda há o rompimento celular através de solventes e lize enzimática, que são processos utilizados para hidrolisar paredes de células microbianas.
Quando aplicada com cuidado, a homogeneização deixa intacta a maioria das organelas celulares. Esses procedimentos quebram a Membrana Plasmática em pequenos fragmentos, no entanto, o núcleo, os lisossomos, os peroxissomos, as mitocôndrias e cloroplastos permanecem intactos.
Quando aplicada com cuidado, a homogeneização deixa intacta a maioria das organelas celulares. Esses procedimentos quebram a Membrana Plasmática em pequenos fragmentos, no entanto, o núcleo, os lisossomos, os peroxissomos, as mitocôndrias e cloroplastos permanecem intactos.
FIGURA 1 - Rompimento de células e tecidos. 3.1. ISOLAMENTO SUBCELULAR
A Centrifugação Diferencial é o método mais utilizado para o isolamento das organelas celulares. Nesse processo ocorre a separação do material celular solúvel do material insolúvel por diferença de massa, densidade e nas diferenças de velocidade com que as estruturas se sedimentam no tubo de centrifugação. As partículas mais densas são coletadas no fundo do tubo como um pellet, e as menos densas permanecem no líquido sobrenadante, que pode ser transferido para outro tubo. Este método foi desenvolvido por Albert Claude, Christian de Duve e seus colegas nas décadas de 40 e 50.
As células isoladas são fracionadas e, então, o homogenato é colocado em tubos e seus componentes passam por uma série de centrifugações em uma ultracentrifuga. Esses tubos são submetidos a uma rotação de alta velocidade, acima de 100.0 rpm, o que gera uma enorme força que leva os componentes celulares a moverem-se em direção ao fundo do tubo da centrífuga e formarem um sedimento.
FIGURA 2 – Ultracentrifugação.
O homogenato celular é centrifugado, inicialmente, a baixa velocidade, o que gera uma pequena força e isso leva as estruturas celulares como o núcleo e as células não-lisadas, que são relativamente grandes e densas, a sedimentarem mais rápido. Os outros componentes da célula permanecem em uma solução remanescente, denominada sobrenadante, que é então centrifugado a alta velocidade para sedimentar as mitocôndrias, os cloroplastos, os lisossomos e os peroxissomos.
Após ocorre a recentrifugação do sobrenadante que ocorre com velocidades ainda mais altas. Esta recentrifugação sedimenta os fragmentos da membrana citoplasmática e do retículo endoplasmático.
Para a sedimentação dos ribossomos ocorrer é necessário que ocorra uma centrifugação com velocidades ainda maiores que a utilizada para a recentrifugação. Isso gera a porção solúvel do citoplasma no sobrenadante, chamada de Citosol.
FIGURA 3 - Esquema mostrando as diferentes etapas da centrifugação fracionada. Uma amostra de fígado é homogeneizada e em seguida submetida a uma série de centrifugações de força crescente (lado esquerdo da figura). Do lado direito estão ilustradas as diferentes subfrações que aparecem ao microscópio eletrônico.
As frações obtidas pela centrifugação diferencial correspondem a preparações enriquecidas, mas ainda não puras, de organelas. Repetidas centrifugações em velocidades progressivamente maiores podem fracionar um homogenato celular em seus vários componentes.
FIGURA 4 - Centrifugação Diferencial.
Na centrifugação em gradiente de densidade o grau de purificação obtido é maior. Neste tipo de centrifugação as organelas são separadas por sedimentação através de uma substância mais densa. Gradientes de densidade são utilizados para aumentar as diferenças de taxas sedimentação de diferentes estruturas.
FIGURA 5 - Separação de organelas por centrifugação por equilíbrio de densidade.
Diversos métodos de centrifugação de homogeneizados são utilizados e a maioria está em solução, geralmente de sacarose, de diferentes concentrações. São utilizadas soluções de açucares devido seu potencial de ajustar-se corretamente e manter a integridade das organelas liberadas da célula.
O objetivo principal do fracionamento subcelular é que ocorra a ruptura da Membrana
Plasmática e que não ocorra à destruição das organelas celulares. Os principais métodos para que isso ocorra são a sonicação, trituração com homogeneizadores mecânicos ou tratamento com maceradores de alta velocidade. Algumas organelas celulares possuem a característica de permanecerem intactas e outras à de se fragmentarem após estes processos.
O objetivo é estudar as formas de isolamento e purificação de organelas celulares e as suas características bioquímicas. Bem como saber qual o método mais indicado para o fracionamento da célula a ser estudada e das organelas, para obter os resultados desejados. Conhecer também as etapas necessárias para o fracionamento nos fornecer os componentes desejados e em condições de uso para o seu estudo.
FRACIONAMENTO SUBCELULAR
O fracionamento subcelular é muito importante para o estudo da química celular, sendo a técnica utilizada para a separação e purificação dos componentes celulares e subcelulares. Os métodos de fracionamento celular realizam a destruição dos limites da célula por diferentes métodos mecânicos ou químicos através da centrifugação de homogeneizados.
A separação das frações subcelulares ocorre de acordo com a massa, superfície e densidade da organela celular. Devido a estas características é possível realizar a análise de diversas frações subcelulares por meio de métodos bioquímicos e microquímicos. Em geral são empregadas soluções de sacarose ou outros açucares. Isto porque as concentrações de açucares podem ser corretamente ajustadas para manter a integridade das organelas liberadas da célula.
O primeiro passo para a purificação de uma célula é o rompimento da Membrana
Plasmática sob condições em que não ocorra a destruição dos componentes internos da célula. Os quatro procedimentos mais utilizados são a Sonicação, uso de Homogeneizador a Alta Pressão, o uso de Maceradores de Alta Velocidade (Moinho de bolas) e o uso de Detergentes.
A Sonicação é exposição da célula a vibrações da ordem de 20kHz convertidos em um meio líquido, causando o fenômeno da cavitação. Essas vibrações geram focos de baixa pressão no líquido suficientes para a formação de bolhas muito pequenas. A medida que se prolonga o tempo das vibrações essas bolhas entram em colapso, gerando uma onda de choques que circulam pelo meio líquido e resultam em impacto e aumento da tensão de cisalhamento, o que causa o rompimento celular. O aparelho utilizado chama-se “sonicador” e transmite a energia ultra-sônica por uma sonda
Homogeneizadores a Alta Pressão tem como princípio de funcionamento o forçamento da passagem da suspensão celular por um orifício estreito seguida de colisão contra uma superfície rígida e imóvel em uma câmara à pressão atmosférica, ou colisão contra um segundo fluxo sob pressão elevada. A redução instantânea da pressão associada ao impacto provoca o rompimento celular sem danificar biomoléculas. Esse rompimento provoca aumento da temperatura do meio, e, por causa disso, o equipamento deve ter um eficiente sistema de refrigeração, principalmente nos casos em que a molécula-alvo é termossensível.
No tratamento com Maceradores de Alta Velocidade as células são esmagadas entre as paredes de um frasco de vidro e um bastão que gira dentro dele. As condições de rompimento nesse equipamento são facilmente controláveis e a eficiência do processo depende da geometria da câmara de rompimento, da velocidade e do tipo de agitador, do tamanho das esferas, da carga das esferas e da concentração celular, da velocidade de alimentação e da temperatura.
Abertura dos orifícios da Membrana Plasmática pode também ser feita através do uso de Detergentes Suaves. Como exemplo de agentes tensoativos há os sais biliares, o lauril sulfato de sódio, o SDS (dodecil sulfato de sódio) e o Triton. A eficiência do rompimento depende do pH e da temperatura e pode ser aumentada por um pré-tratamento à base de solventes orgânicos, como a acetona, que iniciam a estimular a autólise.
Ainda há o rompimento celular através de solventes e lize enzimática, que são processos utilizados para hidrolisar paredes de células microbianas.
Quando aplicada com cuidado, a homogeneização deixa intacta a maioria das organelas celulares. Esses procedimentos quebram a Membrana Plasmática em pequenos fragmentos, no entanto, o núcleo, os lisossomos, os peroxissomos, as mitocôndrias e cloroplastos permanecem intactos.
O fracionamento celular é utilizado para isolar os diferentes componentes celulares e consiste na homogeneização ou destruição das células por meio de diferentes procedimentos mecânicos ou químicos. Estes procedimentos rompem as membranas plasmáticas e separam as frações subcelulares através, da centrifugação, de acordo com sua massa, superfície e peso específicos.
Diversos métodos de centrifugação de homogeneizados são utilizados e a maioria está em solução, geralmente de sacarose, de diferentes concentrações. São utilizadas soluções de açucares devido seu potencial de ajustar-se corretamente e manter a integridade das organelas liberadas da célula.
O objetivo principal do fracionamento subcelular é que ocorra a ruptura da Membrana
Plasmática e que não ocorra à destruição das organelas celulares. Os principais métodos para que isso ocorra são a sonicação, trituração com homogeneizadores mecânicos ou tratamento com maceradores de alta velocidade. Algumas organelas celulares possuem a característica de permanecerem intactas e outras à de se fragmentarem após estes processos.
O objetivo é estudar as formas de isolamento e purificação de organelas celulares e as suas características bioquímicas. Bem como saber qual o método mais indicado para o fracionamento da célula a ser estudada e das organelas, para obter os resultados desejados. Conhecer também as etapas necessárias para o fracionamento nos fornecer os componentes desejados e em condições de uso para o seu estudo.
FRACIONAMENTO SUBCELULAR
O fracionamento subcelular é muito importante para o estudo da química celular, sendo a técnica utilizada para a separação e purificação dos componentes celulares e subcelulares. Os métodos de fracionamento celular realizam a destruição dos limites da célula por diferentes métodos mecânicos ou químicos através da centrifugação de homogeneizados.
A separação das frações subcelulares ocorre de acordo com a massa, superfície e densidade da organela celular. Devido a estas características é possível realizar a análise de diversas frações subcelulares por meio de métodos bioquímicos e microquímicos. Em geral são empregadas soluções de sacarose ou outros açucares. Isto porque as concentrações de açucares podem ser corretamente ajustadas para manter a integridade das organelas liberadas da célula.
O primeiro passo para a purificação de uma célula é o rompimento da Membrana
Plasmática sob condições em que não ocorra a destruição dos componentes internos da célula. Os quatro procedimentos mais utilizados são a Sonicação, uso de Homogeneizador a Alta Pressão, o uso de Maceradores de Alta Velocidade (Moinho de bolas) e o uso de Detergentes.
A Sonicação é exposição da célula a vibrações da ordem de 20kHz convertidos em um meio líquido, causando o fenômeno da cavitação. Essas vibrações geram focos de baixa pressão no líquido suficientes para a formação de bolhas muito pequenas. A medida que se prolonga o tempo das vibrações essas bolhas entram em colapso, gerando uma onda de choques que circulam pelo meio líquido e resultam em impacto e aumento da tensão de cisalhamento, o que causa o rompimento celular. O aparelho utilizado chama-se “sonicador” e transmite a energia ultra-sônica por uma sonda
Homogeneizadores a Alta Pressão tem como princípio de funcionamento o forçamento da passagem da suspensão celular por um orifício estreito seguida de colisão contra uma superfície rígida e imóvel em uma câmara à pressão atmosférica, ou colisão contra um segundo fluxo sob pressão elevada. A redução instantânea da pressão associada ao impacto provoca o rompimento celular sem danificar biomoléculas. Esse rompimento provoca aumento da temperatura do meio, e, por causa disso, o equipamento deve ter um eficiente sistema de refrigeração, principalmente nos casos em que a molécula-alvo é termossensível.
No tratamento com Maceradores de Alta Velocidade as células são esmagadas entre as paredes de um frasco de vidro e um bastão que gira dentro dele. As condições de rompimento nesse equipamento são facilmente controláveis e a eficiência do processo depende da geometria da câmara de rompimento, da velocidade e do tipo de agitador, do tamanho das esferas, da carga das esferas e da concentração celular, da velocidade de alimentação e da temperatura.
Abertura dos orifícios da Membrana Plasmática pode também ser feita através do uso de Detergentes Suaves. Como exemplo de agentes tensoativos há os sais biliares, o lauril sulfato de sódio, o SDS (dodecil sulfato de sódio) e o Triton. A eficiência do rompimento depende do pH e da temperatura e pode ser aumentada por um pré-tratamento à base de solventes orgânicos, como a acetona, que iniciam a estimular a autólise.
Ainda há o rompimento celular através de solventes e lize enzimática, que são processos utilizados para hidrolisar paredes de células microbianas.
Quando aplicada com cuidado, a homogeneização deixa intacta a maioria das organelas celulares. Esses procedimentos quebram a Membrana Plasmática em pequenos fragmentos, no entanto, o núcleo, os lisossomos, os peroxissomos, as mitocôndrias e cloroplastos permanecem intactos.
O fracionamento celular é utilizado para isolar os diferentes componentes celulares e consiste na homogeneização ou destruição das células por meio de diferentes procedimentos mecânicos ou químicos. Estes procedimentos rompem as membranas plasmáticas e separam as frações subcelulares através, da centrifugação, de acordo com sua massa, superfície e peso específicos.
Diversos métodos de centrifugação de homogeneizados são utilizados e a maioria está em solução, geralmente de sacarose, de diferentes concentrações. São utilizadas soluções de açucares devido seu potencial de ajustar-se corretamente e manter a integridade das organelas liberadas da célula.
O objetivo principal do fracionamento subcelular é que ocorra a ruptura da Membrana
Plasmática e que não ocorra à destruição das organelas celulares. Os principais métodos para que isso ocorra são a sonicação, trituração com homogeneizadores mecânicos ou tratamento com maceradores de alta velocidade. Algumas organelas celulares possuem a característica de permanecerem intactas e outras à de se fragmentarem após estes processos.
O objetivo é estudar as formas de isolamento e purificação de organelas celulares e as suas características bioquímicas. Bem como saber qual o método mais indicado para o fracionamento da célula a ser estudada e das organelas, para obter os resultados desejados. Conhecer também as etapas necessárias para o fracionamento nos fornecer os componentes desejados e em condições de uso para o seu estudo.
FRACIONAMENTO SUBCELULAR
O fracionamento subcelular é muito importante para o estudo da química celular, sendo a técnica utilizada para a separação e purificação dos componentes celulares e subcelulares. Os métodos de fracionamento celular realizam a destruição dos limites da célula por diferentes métodos mecânicos ou químicos através da centrifugação de homogeneizados.
A separação das frações subcelulares ocorre de acordo com a massa, superfície e densidade da organela celular. Devido a estas características é possível realizar a análise de diversas frações subcelulares por meio de métodos bioquímicos e microquímicos. Em geral são empregadas soluções de sacarose ou outros açucares. Isto porque as concentrações de açucares podem ser corretamente ajustadas para manter a integridade das organelas liberadas da célula.
O primeiro passo para a purificação de uma célula é o rompimento da Membrana
Plasmática sob condições em que não ocorra a destruição dos componentes internos da célula. Os quatro procedimentos mais utilizados são a Sonicação, uso de Homogeneizador a Alta Pressão, o uso de Maceradores de Alta Velocidade (Moinho de bolas) e o uso de Detergentes.
A Sonicação é exposição da célula a vibrações da ordem de 20kHz convertidos em um meio líquido, causando o fenômeno da cavitação. Essas vibrações geram focos de baixa pressão no líquido suficientes para a formação de bolhas muito pequenas. A medida que se prolonga o tempo das vibrações essas bolhas entram em colapso, gerando uma onda de choques que circulam pelo meio líquido e resultam em impacto e aumento da tensão de cisalhamento, o que causa o rompimento celular. O aparelho utilizado chama-se “sonicador” e transmite a energia ultra-sônica por uma sonda
Homogeneizadores a Alta Pressão tem como princípio de funcionamento o forçamento da passagem da suspensão celular por um orifício estreito seguida de colisão contra uma superfície rígida e imóvel em uma câmara à pressão atmosférica, ou colisão contra um segundo fluxo sob pressão elevada. A redução instantânea da pressão associada ao impacto provoca o rompimento celular sem danificar biomoléculas. Esse rompimento provoca aumento da temperatura do meio, e, por causa disso, o equipamento deve ter um eficiente sistema de refrigeração, principalmente nos casos em que a molécula-alvo é termossensível.
No tratamento com Maceradores de Alta Velocidade as células são esmagadas entre as paredes de um frasco de vidro e um bastão que gira dentro dele. As condições de rompimento nesse equipamento são facilmente controláveis e a eficiência do processo depende da geometria da câmara de rompimento, da velocidade e do tipo de agitador, do tamanho das esferas, da carga das esferas e da concentração celular, da velocidade de alimentação e da temperatura.
Abertura dos orifícios da Membrana Plasmática pode também ser feita através do uso de Detergentes Suaves. Como exemplo de agentes tensoativos há os sais biliares, o lauril sulfato de sódio, o SDS (dodecil sulfato de sódio) e o Triton. A eficiência do rompimento depende do pH e da temperatura e pode ser aumentada por um pré-tratamento à base de solventes orgânicos, como a acetona, que iniciam a estimular a autólise.
Ainda há o rompimento celular através de solventes e lize enzimática, que são processos utilizados para hidrolisar paredes de células microbianas.
Quando aplicada com cuidado, a homogeneização deixa intacta a maioria das organelas celulares. Esses procedimentos quebram a Membrana Plasmática em pequenos fragmentos, no entanto, o núcleo, os lisossomos, os peroxissomos, as mitocôndrias e cloroplastos permanecem intactos.
Quando aplicada com cuidado, a homogeneização deixa intacta a maioria das organelas celulares. Esses procedimentos quebram a Membrana Plasmática em pequenos fragmentos, no entanto, o núcleo, os lisossomos, os peroxissomos, as mitocôndrias e cloroplastos permanecem intactos.
FIGURA 1 - Rompimento de células e tecidos. 3.1. ISOLAMENTO SUBCELULAR
A Centrifugação Diferencial é o método mais utilizado para o isolamento das organelas celulares. Nesse processo ocorre a separação do material celular solúvel do material insolúvel por diferença de massa, densidade e nas diferenças de velocidade com que as estruturas se sedimentam no tubo de centrifugação. As partículas mais densas são coletadas no fundo do tubo como um pellet, e as menos densas permanecem no líquido sobrenadante, que pode ser transferido para outro tubo. Este método foi desenvolvido por Albert Claude, Christian de Duve e seus colegas nas décadas de 40 e 50.
As células isoladas são fracionadas e, então, o homogenato é colocado em tubos e seus componentes passam por uma série de centrifugações em uma ultracentrifuga. Esses tubos são submetidos a uma rotação de alta velocidade, acima de 100.0 rpm, o que gera uma enorme força que leva os componentes celulares a moverem-se em direção ao fundo do tubo da centrífuga e formarem um sedimento.
FIGURA 2 – Ultracentrifugação.
O homogenato celular é centrifugado, inicialmente, a baixa velocidade, o que gera uma pequena força e isso leva as estruturas celulares como o núcleo e as células não-lisadas, que são relativamente grandes e densas, a sedimentarem mais rápido. Os outros componentes da célula permanecem em uma solução remanescente, denominada sobrenadante, que é então centrifugado a alta velocidade para sedimentar as mitocôndrias, os cloroplastos, os lisossomos e os peroxissomos.
Após ocorre a recentrifugação do sobrenadante que ocorre com velocidades ainda mais altas. Esta recentrifugação sedimenta os fragmentos da membrana citoplasmática e do retículo endoplasmático.
Para a sedimentação dos ribossomos ocorrer é necessário que ocorra uma centrifugação com velocidades ainda maiores que a utilizada para a recentrifugação. Isso gera a porção solúvel do citoplasma no sobrenadante, chamada de Citosol.
FIGURA 3 - Esquema mostrando as diferentes etapas da centrifugação fracionada. Uma amostra de fígado é homogeneizada e em seguida submetida a uma série de centrifugações de força crescente (lado esquerdo da figura). Do lado direito estão ilustradas as diferentes subfrações que aparecem ao microscópio eletrônico.
As frações obtidas pela centrifugação diferencial correspondem a preparações enriquecidas, mas ainda não puras, de organelas. Repetidas centrifugações em velocidades progressivamente maiores podem fracionar um homogenato celular em seus vários componentes.
FIGURA 4 - Centrifugação Diferencial.
Na centrifugação em gradiente de densidade o grau de purificação obtido é maior. Neste tipo de centrifugação as organelas são separadas por sedimentação através de uma substância mais densa. Gradientes de densidade são utilizados para aumentar as diferenças de taxas sedimentação de diferentes estruturas.
FIGURA 5 - Separação de organelas por centrifugação por equilíbrio de densidade.
Na centrifugação por velocidade, as partículas de diferentes tamanhos sedimentam através do gradiente em taxas de velocidades diferentes, quando colocados em uma solução salina diluída. Para impedir que os componentes se misturem e para estabilizá-los, durante a sedimentação, a solução contém um gradiente de sacarose. Quando os componentes sedimentam, devido à sacarose, separam-se em diferentes bandas que podem ser recolhidas individualmente, por punção do tubo plástico da centrífuga e coletando-se as gotas que se formam no fundo do tubo.
FIGURA 6 - Velocidade de Sedimentação.
A centrifugação de equilíbrio é usada para separar componentes subcelulares com base nas suas densidades de flutuação, independente de seu tamanho ou forma. A amostra é misturada com um gradiente contendo alta concentração de sacarose ou de cloreto de Césio. Cada componente subcelular move-se, por centrifugação, até que sua densidade se iguale à do meio, então atingirá sua posição de equilíbrio. Método utilizado para separar macromoléculas marcadas com diferentes isótopos.
FIGURA 7 - Amostras centrifugadas para atingirem a posição de equilíbrio, onde a sua densidade se iguala à densidade da solução de sacarose (a) e a de cloreto de césio (b).
ISOLAMENTO DE MEMBRANA PLASMÁTICA
O isolamento de membranas implica em problemas técnicos e delicados, que são resolvidos usando células livres, desprovidas de núcleo e de orgânulos citoplasmáticos, os glóbulos vermelhos dos mamíferos ou hemácias.
ISOLAMENTO DE MEMBRANAS PLASMÁTICAS DE HEMÁCIAS
Após lavar as hemácias em uma solução salina isotônica, torna-se o meio hipotônico adicionando-se água destilada. As membranas intumescem, arrebentam e perdem seu hialoplasma. Então, por centrifugação obtém-se um depósito de membranas plasmáticas, também chamadas de “fantasmas de hemácias”.
ISOLAMENTO DE MEMBRANAS PLASMÁTICAS DE AMEBAS
Em amebas é utilizado um meio hipertônico para isolar as membranas plasmáticas.
Mas na prática as amebas são colocadas numa solução aquosa de glicerol a 50%, durante uma semana. Sob a ação do meio hipertônico, o hialoplasma se desloca da membrana plasmática e retrai-se ao redor do núcleo arrastando os orgânulos citoplasmáticos. Então as membranas plasmáticas são fragmentadas por trituração e após são centrifugadas, a pequenas velocidades, onde os corpos celulares ficam reunidos e se depositam, deixando os fragmentos de membranas plasmáticas sobrenadante.
ISOLAMENTO DE MEMBRANAS PLASMÁTICAS DE CÉLULAS HEPÁTICAS
Este isolamento é realizado através de homogenados de fígado obtidos por trituração. Os vários orgânulos são, em seguida, separados pelo método de ultracentrifugação diferencial.
ISOLAMENTO E EXTRAÇÃO DE DETERMINADOS CONSTITUINTES HIALOPLASMÁTICOS
A ultracentrifugação diferencial é utilizada para isolar os diferentes orgânulos citoplasmáticos, deixando no sobrenadante a parte solúvel do hialoplasma em estado diluído. Os constituintes insolúveis como filamentos e grânulos sedimentam junto com os orgânulos durante a centrifugação.
ISOLAMENTO DE ORGÂNELAS CELULARES
ISOLAMENTO DE FRAÇÕES E SUBFRAÇÕES DE RIBOSSOMOS
A técnica utilizada para o isolamento de ribossomos livres no hialoplasma (bactérias, lêvedos, glóbulos vermelhos jovens ou reticulócitos) é diferente da utilizada em ribossomos presos às membranas do retículo (ergastoplasma das células exócrinas do pâncreas ou hepatócitos).
As células com ribossomos livres são trituradas mecanicamente numa solução de sacarose 0,88M, contendo cloreto de magnésio 0,01M. Em seguida o homogeneizado é submetido a uma centrifugação fracionada para eliminar os núcleos, as mitocôndrias e os resíduos celulares que se depositam conjuntamente. Após o sobrenadante é centrifugado durante uma hora, onde os ribossomos que se encontravam em suspensão se sedimentam, constituindo a fração de ribossomos das células.
http://www.ebah.com.br/content/ABAAAfhNwAH/fracionamento-subcelular
Os principais métodos de estudos utilizados na biologia celular
Métodos para estudo das células:
Os métodos para estudo das células são bastante diversificados e o conhecimento sobre elas progridem com o aperfeiçoamento das técnicas de estudo.
Somos levados a novas descobertas cada vez que aparece um novo instrumento de trabalho ou o aperfeiçoamento de um já utilizado.
O estudo da célula começou através do microscópio óptico (eficiente, mas limitado).
Com o surgimento do microscópio eletrônico, houve um grande impulso para o conhecimento das funções celulares. Sua influência foi tão grande que levou a uma revisão dos conceitos morfológicos de seus constituintes (tanto que, hoje a forma e a estrutura das organelas são descritas conforme nele aparecem).
Muitos outros instrumentos e técnicas de estudo como cultura de células, radioautografia, o microscópio de fluorescência, o microscópio eletrônico de varredura, técnicas de criofratura e bioquímicas, ou seja, todo o arsenal técnico disponível, contribuiu para ampliar o estudo das células.
Os conhecimentos sobre as células progridem paralelamente ao aperfeiçoamento dos métodos de investigação. Inicialmente, o microscópio óptico possibilitou o descobrimento das células e a elaboração da teoria de que todos os seres vivos são constituídos por células.
Posteriormente foram descobertas técnicas citoquímicas que possibilitaram a identificação e a localização de diversas moléculas constituintes das células. Com o advento dos microscópios eletrônicos, que têm grande poder de resolução, foram observados pormenores da estrutura celular que não poderiam sequer ser imaginados pelos estudos feitos com o microscópio óptico.
Embora seja possível o estudo microscópico de células vivas, muitas vezes há vantagem em obter um preparado permanente (lâmina) no qual as células ficam preservadas, isto é, fixadas e coradas para melhor demonstrar seus componentes.
Todos os preparados apresentam artefatos que são alterações produzidas nas células pelas técnicas utilizadas.
A primeira etapa na preparação de uma amostra para exame ao microscópio é a fixação. Suas finalidades são de evitar a destruição das células por suas próprias enzimas (a autólise), evitar a proliferação e atividades de bactérias, endurecer as células para que resistam às etapas seguintes, aumentar a afinidade das estruturas celulares pelos corantes utilizados na microscopia óptica e aumentar o contraste na microscopia eletrônica.
Numerosas substâncias químicas e misturas são utilizadas como fixadores, um dos melhores e mais utilizado é o formaldeído.
Cada um dos fixadores simples apresenta certos inconvenientes, ao lado de algumas qualidades desejáveis. Por isso foram elaboradas as misturas fixadoras que contém proporções variáveis dos fixadores simples com a finalidade de compensar-lhes as deficiências.
Microtomia:
Em sua maioria as células fazem parte de tecidos que precisam ser cortados em fatias finas. Para obtenção dos cortes a serem estudados nos microscópio óptico, os tecidos devem ser embebidos e envolvidos por uma substância de consistência firme. As mais usadas são a parafina e as resinas plásticas.
Depois de protegidos e envolvidos nesse material o tecido é colocado em um instrumento (aparelho) de corte chamado Micrótomo, nele o tecido influído é seccionado por uma navalha, obtendo-se geralmente cortes de 1 a 6 µm de espessura. Para o microscópio Óptico é usado o corte com navalhas de aço.
Os cortes são colocados sobre uma lâmina com pequena quantidade de albumina que serve como adesivo. Neste ponto as amostras ainda não estão prontas para o exame ao microscópio, já que o tecido está impregnado com parafina e o corte é incolor. Remove-se então a parafina, e o tecido é reidratado, sendo em seguida corado.
Quando se deseja estudar lipídios, evita-se o emprego de solventes graças ao uso do Micrótomo de congelação, no qual o tecido é endurecido por congelação,o que permite seu corte. Este tipo de micrótomo e outro tipo mais elaborado e mais eficiente denominado Criostato, permitem a obtenção rápida de cortes, sem passar pelas etapas de quando se usa a parafina. São muito utilizados em hospitais, quando se necessita de um diagnóstico rápido em material patológico.
Nessa mesma perspectiva, um breve resumo quanto a microscopia:
Microscopia Óptica:
O microscópio óptico, também conhecido como microscópio de luz, compõe-se de uma parte mecânica, que serve de suporte, uma parte óptica, constituída por três sistemas de lentes: o condensador, a objetiva e a ocular (Junqueira e Carneiro, 2005). Poder de resolução é a capacidade de o instrumento dar imagens individuais de pontos situados muito próximos uns dos outros, depende do comprimento de onda da luz utilizada e da abertura numérica da objectiva ( AN) (De Robertis et al., 2008).
Limite de resolução é a menor distância que pode existir entre dois pontos para que eles apareçam individualizados (Junqueira e Carneiro, 2005).Figure 1: Microscópio Óptico (Junqueira e Carneiro, 2004)
1.1. Microscópio de constraste de fase
Poder de resolução: 0,2μm
O microscópio de contraste de fase foi desenvolvido para aumentar as diferenças de contraste entre células e o meio ao redor, possibilitando ver as células vivas sem corá-las (Brooks et al., 2009).
O microscópio de contraste de fase é empregado em especial para o estudo decélulas vivas. É de grande utilidade para observação de células cultivadas, cujo crescimento e divisão mitótica podem ser facilmente seguidos sem o emprego de corantes (Junqueira e Carneiro, 2005).
1.2. Microscópio de interferência
O microscópio de interferência se baseia em princípios similares aos do microscópio de contraste de fase, embora tenha a vantagem de fornecer resultados quantitativos einformações adicionais sobre as propriedades físicas dos componentes celulares. Com este instrumento, é possível determinar alterações no índice de refração, enquanto o microscópio de contraste de fase somente revela as descontinuidades mais notáveis. Nos dias de hoje é utilizado um tipo especial de microscópio de interferência diferencial, denominado microscópio de Nomarski. O microscópio deNomarski pode ser acoplado a uma câmara de televisão de alta resolução para aproveitar as vantagens que esta pode oferecer quanto ao detectar os contrastes muito melhor do que o olho humano. As imagens recolhidas são transferidas para um computador e processadas digitalmente para aumentar ainda mais as diferenças de intensidade e diminuir a relação sinal-ruido (De Robertis et al., 2008).
1.3.Microscópio de fluorescência
Poder de resolução: 0,2μm
O microscópio de fluorescência contém uma fonte de luz ultravioleta (UV) embutida. Quando a luz incide em certos corantes e pigmentos, essas substâncias emitem uma luz de comprimento de onda mais longo, fazendo com que brilhem contra um fundo escuro. O microscópio de fluorescência é frequentemente utilizado em laboratórios de imunologia parademonstrar que anticorpos corados com um corante fluorescente se combinaram com antígenos específicos; este procedimento é um tipo de imunodiagnóstico (Burton e Englkirk, 2005).
Referências:
http://www.zemoleza.com.br/trabalho-academico/biologicas/farmacia/metodos-para-estudo-das-celulas/
http://www.trabalhosfeitos.com/ensaios/Metodos-De-Estudo-Em-Biologia-Celular/31659625.html
Os métodos para estudo das células são bastante diversificados e o conhecimento sobre elas progridem com o aperfeiçoamento das técnicas de estudo.
Somos levados a novas descobertas cada vez que aparece um novo instrumento de trabalho ou o aperfeiçoamento de um já utilizado.
O estudo da célula começou através do microscópio óptico (eficiente, mas limitado).
Com o surgimento do microscópio eletrônico, houve um grande impulso para o conhecimento das funções celulares. Sua influência foi tão grande que levou a uma revisão dos conceitos morfológicos de seus constituintes (tanto que, hoje a forma e a estrutura das organelas são descritas conforme nele aparecem).
Muitos outros instrumentos e técnicas de estudo como cultura de células, radioautografia, o microscópio de fluorescência, o microscópio eletrônico de varredura, técnicas de criofratura e bioquímicas, ou seja, todo o arsenal técnico disponível, contribuiu para ampliar o estudo das células.
Os conhecimentos sobre as células progridem paralelamente ao aperfeiçoamento dos métodos de investigação. Inicialmente, o microscópio óptico possibilitou o descobrimento das células e a elaboração da teoria de que todos os seres vivos são constituídos por células.
Posteriormente foram descobertas técnicas citoquímicas que possibilitaram a identificação e a localização de diversas moléculas constituintes das células. Com o advento dos microscópios eletrônicos, que têm grande poder de resolução, foram observados pormenores da estrutura celular que não poderiam sequer ser imaginados pelos estudos feitos com o microscópio óptico.
Embora seja possível o estudo microscópico de células vivas, muitas vezes há vantagem em obter um preparado permanente (lâmina) no qual as células ficam preservadas, isto é, fixadas e coradas para melhor demonstrar seus componentes.
Todos os preparados apresentam artefatos que são alterações produzidas nas células pelas técnicas utilizadas.
A primeira etapa na preparação de uma amostra para exame ao microscópio é a fixação. Suas finalidades são de evitar a destruição das células por suas próprias enzimas (a autólise), evitar a proliferação e atividades de bactérias, endurecer as células para que resistam às etapas seguintes, aumentar a afinidade das estruturas celulares pelos corantes utilizados na microscopia óptica e aumentar o contraste na microscopia eletrônica.
Numerosas substâncias químicas e misturas são utilizadas como fixadores, um dos melhores e mais utilizado é o formaldeído.
Cada um dos fixadores simples apresenta certos inconvenientes, ao lado de algumas qualidades desejáveis. Por isso foram elaboradas as misturas fixadoras que contém proporções variáveis dos fixadores simples com a finalidade de compensar-lhes as deficiências.
Microtomia:
Em sua maioria as células fazem parte de tecidos que precisam ser cortados em fatias finas. Para obtenção dos cortes a serem estudados nos microscópio óptico, os tecidos devem ser embebidos e envolvidos por uma substância de consistência firme. As mais usadas são a parafina e as resinas plásticas.
Depois de protegidos e envolvidos nesse material o tecido é colocado em um instrumento (aparelho) de corte chamado Micrótomo, nele o tecido influído é seccionado por uma navalha, obtendo-se geralmente cortes de 1 a 6 µm de espessura. Para o microscópio Óptico é usado o corte com navalhas de aço.
Os cortes são colocados sobre uma lâmina com pequena quantidade de albumina que serve como adesivo. Neste ponto as amostras ainda não estão prontas para o exame ao microscópio, já que o tecido está impregnado com parafina e o corte é incolor. Remove-se então a parafina, e o tecido é reidratado, sendo em seguida corado.
Quando se deseja estudar lipídios, evita-se o emprego de solventes graças ao uso do Micrótomo de congelação, no qual o tecido é endurecido por congelação,o que permite seu corte. Este tipo de micrótomo e outro tipo mais elaborado e mais eficiente denominado Criostato, permitem a obtenção rápida de cortes, sem passar pelas etapas de quando se usa a parafina. São muito utilizados em hospitais, quando se necessita de um diagnóstico rápido em material patológico.
Nessa mesma perspectiva, um breve resumo quanto a microscopia:
Microscopia Óptica:
O microscópio óptico, também conhecido como microscópio de luz, compõe-se de uma parte mecânica, que serve de suporte, uma parte óptica, constituída por três sistemas de lentes: o condensador, a objetiva e a ocular (Junqueira e Carneiro, 2005). Poder de resolução é a capacidade de o instrumento dar imagens individuais de pontos situados muito próximos uns dos outros, depende do comprimento de onda da luz utilizada e da abertura numérica da objectiva ( AN) (De Robertis et al., 2008).
Limite de resolução é a menor distância que pode existir entre dois pontos para que eles apareçam individualizados (Junqueira e Carneiro, 2005).Figure 1: Microscópio Óptico (Junqueira e Carneiro, 2004)
1.1. Microscópio de constraste de fase
Poder de resolução: 0,2μm
O microscópio de contraste de fase foi desenvolvido para aumentar as diferenças de contraste entre células e o meio ao redor, possibilitando ver as células vivas sem corá-las (Brooks et al., 2009).
O microscópio de contraste de fase é empregado em especial para o estudo decélulas vivas. É de grande utilidade para observação de células cultivadas, cujo crescimento e divisão mitótica podem ser facilmente seguidos sem o emprego de corantes (Junqueira e Carneiro, 2005).
1.2. Microscópio de interferência
O microscópio de interferência se baseia em princípios similares aos do microscópio de contraste de fase, embora tenha a vantagem de fornecer resultados quantitativos einformações adicionais sobre as propriedades físicas dos componentes celulares. Com este instrumento, é possível determinar alterações no índice de refração, enquanto o microscópio de contraste de fase somente revela as descontinuidades mais notáveis. Nos dias de hoje é utilizado um tipo especial de microscópio de interferência diferencial, denominado microscópio de Nomarski. O microscópio deNomarski pode ser acoplado a uma câmara de televisão de alta resolução para aproveitar as vantagens que esta pode oferecer quanto ao detectar os contrastes muito melhor do que o olho humano. As imagens recolhidas são transferidas para um computador e processadas digitalmente para aumentar ainda mais as diferenças de intensidade e diminuir a relação sinal-ruido (De Robertis et al., 2008).
1.3.Microscópio de fluorescência
Poder de resolução: 0,2μm
O microscópio de fluorescência contém uma fonte de luz ultravioleta (UV) embutida. Quando a luz incide em certos corantes e pigmentos, essas substâncias emitem uma luz de comprimento de onda mais longo, fazendo com que brilhem contra um fundo escuro. O microscópio de fluorescência é frequentemente utilizado em laboratórios de imunologia parademonstrar que anticorpos corados com um corante fluorescente se combinaram com antígenos específicos; este procedimento é um tipo de imunodiagnóstico (Burton e Englkirk, 2005).
Referências:
http://www.zemoleza.com.br/trabalho-academico/biologicas/farmacia/metodos-para-estudo-das-celulas/
http://www.trabalhosfeitos.com/ensaios/Metodos-De-Estudo-Em-Biologia-Celular/31659625.html
Biologia Celular, Métodos de Estudos
A Biologia Celular é o ramo de estudos que se volta para as células, as unidades funcionais dos seres vivos.
A Biologia Celular, também chamada de Citologia, é a parte da Biologia que se dedica ao estudo das células e suas estruturas. É uma área bastante importante, uma vez que a célula é a menor unidade viva de um organismo e é utilizada para diferenciar um ser vivo daquele que não apresenta vida.
As células começaram a ser estudadas a partir dos trabalhos com cortiça realizados por Robert Hooke em 1665. Esse pesquisador inglês foi o primeiro a visualizar células em um microscópio. Como ele verificou células de cortiça mortas, acreditou que essas estruturas eram apenas câmaras vazias, daí a denominação célula, que significa pequena cela.
Com o desenvolvimento dos microscópios e estudos mais aprofundados em outros materiais, percebeu-se que todos os seres vivos apresentavam células e estas eram muito mais complexas do que as estruturas visualizadas por Hooke. Os trabalhos do botânico Mathias Schleiden e do zoólogo Theodor Schwann foram fundamentais para a construção da chamada Teoria Celular, que dizia que todos os seres vivos eram compostos por células.
Em 1855, Rudolf Virchow publicou um trabalho em que ele afirmava que todas as células originavam-se de outra célula preexistente. Entretanto, somente em 1878, Walther Flemming observou o processo de divisão celular e conseguiu provar como a multiplicação das células ocorria.
As conclusões obtidas nesses dois trabalhos foram incorporadas à Teoria Celular, que, atualmente, é conhecida por três pontos principais:
→ Todos os organismos vivos são formados por uma ou várias células;
→ As células são as unidades funcionais dos seres vivos;
→ Uma célula somente se origina de outra existente.
Atualmente, admite-se que as células são formadas por três partes básicas: a membrana, o citoplasma e o núcleo. Vale destacar, no entanto, que o mais correto é admitir que todas as células possuem material genético, uma vez que nem todas possuem um núcleo delimitado por uma membrana nuclear, também chamada de carioteca. As células que não possuem membrana nuclear são chamadas de células procarióticas, e as que possuem a membrana recebem a denominação de eucarióticas.
A membrana plasmática de uma célula possui como função principal controlar o que entra e o que sai dessa estrutura. Graças a essa importante característica, dizemos que ela possui permeabilidade seletiva. O modelo que melhor representa a estrutura da membrana atualmente é o modelo do mosaico fluido, que admite que ela é formada por uma bicamada fosfolipídica onde estão imersas proteínas.
O citoplasma é um líquido viscoso presente entre o núcleo e a membrana onde estão localizadas as organelas, que são estruturas responsáveis pelas mais variadas funções da célula. Analisando as organelas celulares, também é possível perceber a diferença entre uma célula eucariótica e uma procariótica. Nessas últimas são encontrados apenas ribossomos, enquanto nas eucarióticas uma variada gama de organelas é observada.
Veja a seguir as principais organelas visualizadas em uma célula:
→ Retículo endoplasmático liso – Relaciona-se, principalmente, com a síntese de lipídios e carboidratos.
→ Retículo endoplasmático rugoso – Responsável pela síntese intensa de proteínas.
→ Ribossomo – Relaciona-se com a síntese de proteínas.
→ Complexo Golgiense – Possui como principal função a secreção celular.
→ Mitocôndrias – Envolvidas no processo de respiração celular.
→ Lisossomo – Organela exclusiva das células animais, o lisossomo está relacionado com a digestão intracelular.
→ Centríolo – Possui importante papel na divisão celular.
→ Peroxissomo – Destrói substâncias tóxicas.
→ Cloroplasto – Atua no processo de fotossíntese, não sendo encontrado, portanto, nas células animais.
→ Vacúolo – Relacionado com a digestão intracelular e acúmulo de substâncias.
Desde o entendimento de que os seres vivos são formados por células até os dias atuais, muito conhecimento sobre a Biologia Celular foi adquirido. Apesar disso, ainda faltam muitos estudos a serem realizados.
Por Ma. Vanessa dos Santos
Sendo assim nessa perspectiva destaco aqui os principais métodos de estudo utilizados na biologia celular segundo minhas pesquisas
Para estudar as células podemos usar métodos ópticos e cito químicos. Os primeiros permitem o exame morfológico dos componentes celulares, enquanto os segundos nos fornecem o conhecimento da composição de suas estruturas.
Métodos ópticos
O estudo das células in vivo, também chamado exame vital, pode ser feito observando a célula diretamente, sem coloração, ou empregando um corante. O exame vital é empregado para o estudo de células livres num meio líquido, de células isoladas de fragmentos de tecidos, de células de membranas ou de partes transparentes de animais (por exemplo, larvas de peixes e anfíbios). Para a coloração destas células usam-se principalmente verde Jacus, o vermelho neutro e o azul de metileno. Tais corantes, pelo fato de não matarem a célula, são denominados corantes vitais.
O estudo das células mortas consiste na preparação de delgadas fatias de tecidos, dispostas sobre lâminas de vidro e com espessura tal que permita a passagem da luz, de modo que as células possam ser estudadas por transparência.
A preparação de um corte de tecido compreende as fases de fixação, corte e coloração.
A fixação pode ser física (calor, congelamento) ou química (por líquidos fixa dores como o álcool, o formol e o ácido acético). A fixação evita a decomposição do tecido.
O corte dos tecidos vegetais pode ser feito com navalha ou lâmina de barbear; o dos tecidos animais é feito com o aparelho denominado micrótomo, que possui um mecanismo semelhante ao aparelho de cortar frios.
Com um pequeno fragmento de tecido obtém-se dezenas de cortes. Para facilitar essa operação, o tecido é previamente congelado ou incluído (mergulhado) em parafina líquida; espera-se então que esta se solidifique com o resfriamento. Em seguida, o fragmento de parafina contendo o tecido é colocado no aparelho. Os cortes obtidos são postos numa vasilha com água morna para que a parafina se derreta. A seguir, com um pincel, colhem-se as fatias de tecido, que são colocadas numa lâmina de vidro para receberem os corantes.
A coloração consiste na aplicação de substâncias corantes aos tecidos. As mais comuns são: azul de metileno, legou, nitrato de prata, verde Jacus, focinha, tetróxido de ósmio, hematoxilina e encena. Estes dois últimos são os corantes mais utilizados em Histologia (estudo dos tecidos). A hematoxilina cora o núcleo de azul-arroxeado; a encena cora o citoplasma de róseo.
Depois de submetida a esse tratamento, a célula pode ser observada ao microscópio. O mais comum, utilizado em escolas de primeiro e segundo graus, é o microscópio óptico. Nas instituições científicas é muito empregado o microscópio eletrônico. Além destes, há outros tipos, usados para finalidades mais restritas.
Microscópio óptico ou microscópio composto é um aparelho que permite observar objetos transparentes grandemente aumentados (centenas de vezes). Sua unidade de medida é o mícron (is), que corresponde à milésima parte do milímetro (1 mícron = 0,001 mm).
Esse microscópio consta de partes mecânicas e partes ópticas conforme se pode observar na figura indicada. As partes mecânicas são: platina, pé, braço, canhão e revólver. As partes ópticas são: ocular e objetiva (sistemas de lentes em contato com o olho e com o objeto, respectivamente), condensador, diafragma e espelho. Esta última peça pode ser dispensada em microscópios com luz artificial direta.
Referências:
http://m.brasilescola.uol.com.br/biologia/nivel-celula.htm
http://www.clickescola.com.br/metodos-de-estudo-das-celulas.htm/
terça-feira, 14 de março de 2017
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